Nature深度綜述展望PROTAC未來20年的四大發(fā)展方向

首個PROTAC分子的論文發(fā)布之后的20年里，這一技術(shù)從學(xué)術(shù)界轉(zhuǎn)化為臨床前和臨床期新藥開發(fā)項目，并且在2019年首次在腫瘤學(xué)領(lǐng)域獲得臨床概念驗證。在過去的2021年，PROTAC等蛋白降解技術(shù)是生物醫(yī)藥行業(yè)的熱詞之一。輝瑞、拜耳、百時美施貴寶、禮來等大型藥企也在這一領(lǐng)域紛紛布局。

近日，蛋白降解領(lǐng)域明星公司Arvinas的聯(lián)合創(chuàng)始人之一，耶魯大學(xué)的Craig M. Crews教授和合作伙伴聯(lián)合在Nature Reviews Drug Discovery上發(fā)表深度綜述，展望了PROTAC靶向蛋白降解技術(shù)未來20年的發(fā)展方向。作者們指出，靶向蛋白降解領(lǐng)域已經(jīng)“整裝待發(fā)”，挑戰(zhàn)此前被認(rèn)為“不可成藥”的靶點。

PROTAC技術(shù)發(fā)展的歷史和目前的臨床開發(fā)狀態(tài)藥明康德內(nèi)容團(tuán)隊已經(jīng)在多篇文章中做過介紹。今天的這篇文章里，藥明康德內(nèi)容團(tuán)隊將著重與讀者分享這篇綜述中，作者列出的PROTAC靶向蛋白降解技術(shù)未來20年的四大發(fā)展方向。

確立最適合蛋白降解的靶點類型

第一波臨床期蛋白降解劑的靶點為已經(jīng)獲得臨床驗證的成熟靶點，比如Arvinas公司選擇的雄激素和雌激素受體。針對這些靶點的成功確立了蛋白降解劑成為一種治療模式。然而，這一治療模式真正的潛力在于觸達(dá)目前治療模式難于成藥或不可成藥的靶點。那么哪些靶點是PROTAC療法的理想靶點。綜述總結(jié)了PROTAC靶點的幾大常見特征，它們包括：

蛋白的過度表達(dá)、突變、聚集、異構(gòu)體表達(dá)或細(xì)胞內(nèi)定位，以功能獲得性的方式導(dǎo)致疾病；

具有能夠被E3連接酶觸達(dá)的結(jié)合表面；

如果有能夠進(jìn)入蛋白酶體的無結(jié)構(gòu)區(qū)域則更為理想。

因為基因突變對常規(guī)靶向療法產(chǎn)生耐藥性的蛋白，具有骨架功能的蛋白和用其它治療模式“不可成藥”的蛋白也可能是適合使用PROTAC技術(shù)的靶點。

▲PROTAC靶點的特征（圖片來源：參考資料[1]）

雖然適合使用PROTAC蛋白降解的靶點不需要一個酶活性位點，它們需要一個能夠被E3連接酶觸達(dá)的小分子結(jié)合位點。這一位點的親和力不需要特別高，通常在1~500 nM的范圍內(nèi)就可以，募集的E3連接酶必須能夠觸達(dá)靶點的表面。

對于骨架蛋白來說，選擇結(jié)合位點尤為關(guān)鍵，因為存在于復(fù)合體中的靶點蛋白只有部分表面暴露出來。對于那些大部分表面都隱藏在復(fù)合體中的靶點，靶向復(fù)合體中的鄰近蛋白不失為一種策略。

雖然與靶點蛋白結(jié)合的配體的親和力不需要很高，但是與E3連接酶結(jié)合的配體應(yīng)該具有強(qiáng)結(jié)合力和緩慢的解離速度。能夠與E3連接酶共價結(jié)合的PROTAC分子能夠?qū)⑷齻€部分（靶點，PROTAC分子和E3連接酶）組裝的動態(tài)變化簡化為兩個部分（靶點，PROTAC/E3連接酶復(fù)合體），這可能增強(qiáng)催化效率。

擴(kuò)展可用的E3連接酶

目前，第一波處于臨床開發(fā)階段的靶向蛋白降解藥物大多傾向于募集名為CRBN的E3連接酶，一個值得關(guān)注的例外是Dialectic Therapeutics公司開發(fā)的BCL-XL降解劑DT2216，它募集了名為VHL的E3連接酶。不過，靶向蛋白降解的潛力讓學(xué)術(shù)界和醫(yī)藥界都在探索新的E3連接酶。人體中有超過600種E3連接酶，綜述指出，目前的問題是基于新E3連接酶的靶向蛋白降解療法何時造福患者，用于治療什么疾病，而不是它們會不會出現(xiàn)。

PROTAC分子的一個優(yōu)勢在于可以根據(jù)靶點，通過選擇募集連接酶的分子和連接子（linker），理性設(shè)計蛋白降解劑。它的模塊式特征意味著針對不同的靶點，可以替換與E3連接酶結(jié)合的模塊，募集達(dá)到最佳治療效果的E3連接酶。

雖然基于募集CRBN和VHL連接酶的PROTAC分子設(shè)計已經(jīng)日漸成熟，它們的臨床前和臨床期開發(fā)仍然面對多重挑戰(zhàn)。尤其在腫瘤學(xué)領(lǐng)域，對治療藥物的耐藥性可以迅速出現(xiàn)，腫瘤可能通過產(chǎn)生基因突變，逃避依賴非必需連接酶（比如CRBN和VHL）的蛋白降解劑的作用。臨床前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有些腫瘤能夠通過在泛素連接酶系統(tǒng)的組成部分中引入突變或降低表達(dá)來逃避蛋白降解劑的作用。這些挑戰(zhàn)給發(fā)現(xiàn)新的E3連接酶帶來機(jī)會。那么，適合臨床開發(fā)的新E3連接酶應(yīng)該具有什么樣的特征？我們應(yīng)該從哪些方向?qū)ふ倚碌腅3連接酶？綜述作者提出了以下幾個方向：

應(yīng)用廣泛，普遍存在的連接酶

這些連接酶和CRBN或VHL一樣，能夠與任何靶點蛋白匹配，從而用于治療很多不同的疾病適應(yīng)癥。目前所有的PROTAC分子都只使用了少數(shù)幾個這種類型的連接酶，它們的信息可以在線上數(shù)據(jù)庫PROTAC-DB中查詢。

有趣的是，針對同一靶點蛋白，募集VHL還是CRBN可能導(dǎo)致不同的降解效率。比如在針對KRAS G12C的蛋白降解劑開發(fā)方面，已有的研究發(fā)現(xiàn)KRAS G12C可以被PROTAC系統(tǒng)靶向，但是降解的效果會受到募集的E3連接酶是VHL還是CRBN的影響。

多個因素可能影響連接酶的降解特征，包括連接酶的構(gòu)象和靶點蛋白之間的互補性；連接酶與靶點蛋白直接構(gòu)成可導(dǎo)致降解的三元結(jié)構(gòu)的能力；不同連接酶和靶點蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位；以及細(xì)胞類型特異性連接酶和靶點的表達(dá)。

綜述指出，基于連接酶的結(jié)構(gòu)特征，可以判斷一些值得用于PROTAC蛋白降解的連接酶，而去年DeepMind和RoseTTAFold在基于氨基酸序列預(yù)測蛋白三維結(jié)構(gòu)方面的突破，可能重新定義哪些連接酶可以用于開發(fā)蛋白降解療法。

組織和細(xì)胞特異性E3連接酶

連接酶的組織和細(xì)胞特異性，以及在腫瘤中的富集程度和是否對腫瘤必不可少，可能為針對特定領(lǐng)域的蛋白降解療法提供開發(fā)機(jī)會。學(xué)術(shù)界和醫(yī)藥行業(yè)都對發(fā)現(xiàn)具有獨特表達(dá)特征的E3連接酶具有濃厚的興趣，從而進(jìn)行精準(zhǔn)靶向蛋白降解（precision TPD），這是蛋白降解領(lǐng)域的“圣杯”之一。

以往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些在特定組織中表達(dá)的E3連接酶，比如名為RNF182和TRIM9的E3連接酶特異性表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中，它們可能對于靶向神經(jīng)元疾病具有重要意義。CNS特異性靶向降解可以避免全身性的脫靶和毒副作用。

有趣的是，有些連接酶在特定組織和細(xì)胞中表達(dá)水平特別低，這一特征對蛋白降解劑來說也可能提供機(jī)會。一個出色的例子是VHL在血小板中的表達(dá)水平低，因此募集VHL的PROTAC分子DT2216在降解BCL-XL的時候能夠避免傷害到血小板，從而降低了血小板導(dǎo)致的毒性，提高了它的治療指數(shù)。目前它處于1期臨床開發(fā)階段。

▲不同類型的E3泛素連接酶（圖片來源：參考資料[1]）

在疾病組織或細(xì)胞中富集的E3連接酶

精準(zhǔn)靶向蛋白降解的另一個前沿是特異性靶向腫瘤細(xì)胞的PROTAC分子。達(dá)成這一目標(biāo)的一個策略是靶向腫瘤特異性或在腫瘤富集的E3連接酶。一般來說，在腫瘤中富集的E3連接酶與腫瘤依賴的E3連接酶重合。這一相關(guān)性可用于發(fā)現(xiàn)對于多種癌癥細(xì)胞類型都必需的E3連接酶，它們的優(yōu)勢在于腫瘤細(xì)胞難于通過連接酶的突變來產(chǎn)生對PROTAC分子的耐藥性。

不過，這類連接酶能否真正改善PROTAC分子的治療指數(shù)還需要實驗驗證。一個潛在問題是在腫瘤中高度富集或者腫瘤依賴的E3連接酶大多跟細(xì)胞周期相關(guān)。基于這些連接酶開發(fā)的PROTAC分子可能產(chǎn)生和經(jīng)典化療藥物類似的毒性，不過這一可能性仍然需要實驗驗證。

最后，癌癥睪丸抗原（CTAs）也包括在正常組織中表達(dá)有限但是在多種癌癥類型中高度表達(dá)的泛素連接酶，一個例子是黑色素瘤抗原基因（MAGE）家族中的泛素E3連接酶。

發(fā)現(xiàn)、研究和開發(fā)腫瘤特異性E3連接酶用于蛋白降解只是獲得腫瘤特異性PROTAC分子的策略之一。另一種策略是利用抗體對腫瘤的特異性，將降解分子偶聯(lián)在腫瘤特異性抗體上。基因泰克（Genentech）和其合作伙伴的研究已經(jīng)展現(xiàn)出抗體偶聯(lián)PROTAC分子的腫瘤靶向特異性。不過，抗體偶聯(lián)PROTAC會失去小分子PROTAC的口服特征。

治療腫瘤學(xué)以外的疾病

目前已經(jīng)獲批的蛋白降解藥物（度胺類藥物）和大多數(shù)新開發(fā)的臨床期PROTAC分子和分子膠化合物用于治療不同類型的癌癥。然而，靶向蛋白降解的范圍正在向腫瘤學(xué)以外的領(lǐng)域擴(kuò)展。

炎癥、免疫和免疫腫瘤學(xué)

在第一波進(jìn)入臨床開發(fā)階段的降解劑中，Nurix公司的布魯頓氏酪氨酸激酶（BTK）抑制劑NX-5948和Kymera公司的IRAK4降解劑（KT-474）將檢驗PROTAC治療模式在非癌癥疾病方面的應(yīng)用。它們可以用于治療多種免疫炎癥疾病，比如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

在免疫檢查點抑制劑獲得成功之后，開發(fā)能夠激發(fā)抗癌免疫反應(yīng)的小分子藥物是藥物開發(fā)的一個重要領(lǐng)域。PROTAC分子具有以小分子藥物的模式激活免疫細(xì)胞，模擬PD-1/PD-L1靶向療法效果，成為潛在“first-in-class”療法的潛力。最近，靶向MAP4K1的PROTAC分子已經(jīng)表現(xiàn)出可喜的臨床前活性。

雖然在這個方面，小分子抑制劑可能達(dá)到同樣的目的，但是PROTAC分子可能具有更好耐受性和更低的毒副作用。

神經(jīng)病學(xué)和神經(jīng)退行性疾病

PROTAC分子的關(guān)鍵性特征之一是能夠降解因為沒有活性位點而不被傳統(tǒng)小分子抑制劑靶向的蛋白。這一特征讓在多種神經(jīng)退行性疾病中積累的蛋白（比如Tau蛋白，α突觸核蛋白，亨廷頓蛋白突變體…）成為潛在靶點。

Tau蛋白病（Tauopathies）是一類小分子藥物難于靶向，但是PROTAC分子可以有所作為的疾病領(lǐng)域。它們包括阿爾茨海默病、額顳葉癡呆（FTD）等神經(jīng)疾病。這些疾病的病理與異常Tau蛋白的聚集和累積相關(guān)，產(chǎn)生的神經(jīng)原纖維纏結(jié)可導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡。

降低Tau蛋白的水平是正在被積極探索的一個研發(fā)方向，在臨床前模型中，使用反義寡核苷酸（ASO）療法已經(jīng)成功降低Tau蛋白水平并逆轉(zhuǎn)Tau蛋白相關(guān)病理。開發(fā)靶向Tau蛋白的PROTAC分子或其它小分子降解劑可以把降低Tau蛋白水平的表型與全身性給藥和穿越血腦屏障的特征結(jié)合在一起，目前是一個尤為受到關(guān)注的領(lǐng)域。

Tau蛋白單體是一個天然無序蛋白，沒有明確的供小分子藥物結(jié)合的“口袋”。然而，小分子探針能夠與Tau蛋白的寡聚體結(jié)合，目前已經(jīng)作為試劑用于PET掃描。一個策略是將這種PET跟蹤劑改裝成募集CRBN的PROTAC分子，它在細(xì)胞培養(yǎng)模型中已經(jīng)表現(xiàn)出降解Tau蛋白的能力。

在帕金森病患者中積累的α突觸核蛋白與Tau蛋白類似，也是一種天然無序蛋白。此前的研究已經(jīng)報告了一款基于多肽的α突觸核蛋白降解劑，它在實驗中保護(hù)神經(jīng)元不受α突觸核蛋白過度表達(dá)引發(fā)的神經(jīng)毒性的傷害。

抗病毒PROTACs

抗病毒PROTAC分子的可行性最初在降解丙肝病毒（HCV）NS3/4A蛋白酶的研究中得到確立。隨著新冠病毒的出現(xiàn)，這一策略也被用于靶向新冠病毒。新冠病毒的主要蛋白酶（Mpro和PLpro）和RNA依賴性RNA聚合酶（RdRP）目前被小分子抑制劑靶向。它們可能成為PROTAC分子的潛在靶點。

Nurix Therapeutics公司目前正在開發(fā)針對新冠病毒的三款蛋白降解劑。

開發(fā)創(chuàng)新PROTAC模式

創(chuàng)新PROTAC策略，包括基于生物制品的PROTACs（bioPROTACs）和雜合體PROTACs（hybrid PROTACs）可能進(jìn)一步擴(kuò)展PROTAC可以靶向的靶點范圍。這篇綜述中將PROTAC分子劃分為三類，傳統(tǒng)的小分子PROTACs，包含多肽或其它生物制品的PROTACs（bioPROTACs）和同時包含多肽和傳統(tǒng)小分子“彈頭”的PROTACs（雜合體PROTACs）。

生物制品PROTACs利用多肽、融合蛋白、以及寡核苷酸等作為識別靶點的配體。基于融合蛋白或者多肽的PROTACs已經(jīng)在研究中成功降解HER2、MYC、KRAS等與癌癥相關(guān)的靶點。基于寡核苷酸的PROTAC可以用于靶向轉(zhuǎn)錄因子和RNA結(jié)合蛋白。這些蛋白如果出現(xiàn)突變，會導(dǎo)致多種類型的癌癥，以及肥胖癥、心血管和神經(jīng)疾病。

這些生物制品PROTACs有潛力成為一種新的治療模式，不過它們的遞送和給藥模式是需要跨越的障礙。這些療法可能需要以基因療法的方式遞送，利用精準(zhǔn)調(diào)控的啟動子來控制細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。基于納米顆粒的遞送技術(shù)和基于病毒載體的基因遞送系統(tǒng)的發(fā)展將在這一治療模式的進(jìn)展中起到重要作用。

短期來看，生物制品PROTACs可以作為工具分子，驅(qū)動小分子PROTACs的開發(fā)，它們可以用于確認(rèn)降解蛋白帶來的完全抑制與小分子抑制劑導(dǎo)致的部分抑制相比，能否帶來更好的生物學(xué)效果；或者比較蛋白表達(dá)后降解與利用RNAi抑制蛋白表達(dá)之間的生物學(xué)區(qū)別；還可以用于確定靶點蛋白的哪個表面能夠被E3連接酶觸達(dá)。

PROTACs也激發(fā)了科學(xué)家們利用非蛋白酶體的降解系統(tǒng)，開發(fā)靶向蛋白降解劑的努力。目前已經(jīng)有LYTAC，ATTEC等多種其它降解模式被開發(fā)出來，它們具有各自獨特的特征。

▲不同靶向蛋白降解策略作為治療模式的特征（圖片來源：參考資料[1]）

結(jié)語

作者表示，基于靶向蛋白降解在過去20年的進(jìn)展和學(xué)術(shù)界與工業(yè)界對它的興趣和投入，很明顯這一技術(shù)可成為一種關(guān)鍵性治療模式。他們相信，這一治療模式具有為廣泛疾病患者提供創(chuàng)新治療選擇的潛力。

參考資料：

[1] Békés et al., (2022). PROTAC targeted protein degraders: the past is prologue. Nature Reviews Drug Discovery, https://doi.org/10.1038/s41573-021-00371-6